Справка - Поиск - Участники - Войти - Регистрация
Полная версия: ДНК в растворе
Частный клуб Алекса Экслера > Наука и техника
Чокки
17 июля 2016, 08:31
Буду очень благодарен если кто-нибудь с расстановкой и очень желательно с ссылками на статьи ответит на следующие вопросы:

1. Откуда при приготовлении образцов ДНК в водном растворе берутся ионы магния и с какими концентрациями?
2. Есть ли фундаментальные причины, по которым ионы там обязаны быть? Судя по литературе, ДНК совершенно спокойно растворяется и не разваливается в дистиллированной и нано-чистой воде.
3. Возможна ли эффективная деионизация?
4. Куда деваются собственно ионы EDTA после деионизации?
mihalich
23 июля 2016, 02:07
Предположу, что от метода выделения "чистой" днк.
Чокки
23 июля 2016, 05:43

mihalich написал: Предположу, что от метода выделения "чистой" днк.

Ну с этим мы тут уже разобрались. Имеется задача вывести ионы из раствора насколько это возможно... Или хотя бы узнать есть ли предельная концентрация, ниже которой ДНК образует в воде аморфный плевок.
BigUglyTurtle
23 июля 2016, 11:24
ДНК это соль, противоионы разные, натрий, калий, магний, далее везде. Поэтому обычные методы обессоливания а-ля гель фильтрация не работают, если нужно избавиться от всех металлов. Для этих целей используют ионообменные резины типа dowex. Аммониевые соли днк довольно стабильны, но нужно исключить контакт со стеклом, иначе все быстренько поменяется обратно на натриевые соли.
Чокки
23 июля 2016, 23:36

BigUglyTurtle написала: ДНК это соль, противоионы разные, натрий, калий, магний, далее везде. Поэтому обычные методы обессоливания а-ля гель фильтрация не работают, если нужно избавиться от всех металлов.

В сущности, не надо "избавиться от всех металлов". Достаточно какой-то статьи, где описывается предельно низкая ионная концентрация, при которой ДНК все еще растворима в воде, а не образует аморфную пакость, которая приклеилась сама к себе.

Рецензенту отвечаем, ну. smile.gif
mihalich
24 июля 2016, 02:16
Растворима она сама по себе за счет PO3-, который как бы ее backbone. Солят для прецепитации и разного другого.
Чокки
24 июля 2016, 02:47

mihalich написал: Растворима она сама по себе за счет PO3-, который как бы ее backbone. Солят для прецепитации и разного другого.

А теперь посмотри сюда. Ионы убрали и получилась какашка. Нам важно, чтобы ДНК осталась растворенной в воде.
BigUglyTurtle
24 июля 2016, 12:59
Вопрос слегка сферический. Какая концентрация днк? Какая днк (длина, последовательность)? Какие у неё противоионы? Протоны? Что имеется в виду под приклеилась сама к себе? Дуплекс это еще сама к себе или уже приклеилась? А если это шпилька? При желании можно подобрать такие условия, при которых ДНК будет аггрегировать в пикомольных концентрациях в тех условиях, в которых другая днк ещё долго будет оставаться в растворе. Другое дело, кто эту днк сделает и как, но это другой вопрос.

ЗЫ Можно мне пдф статьи по ссылке? Я в декрете сейчас, из дома доступа нет. Хочу посмотреть, что они имеют в виду под ДНК.
Чокки
24 июля 2016, 21:37

BigUglyTurtle написала: Вопрос слегка сферический. Какая концентрация днк? Какая днк (длина, последовательность)? Какие у неё противоионы? Протоны? Что имеется в виду под приклеилась сама к себе? Дуплекс это еще сама к себе или уже приклеилась? А если это шпилька? При желании можно подобрать такие условия, при которых ДНК будет аггрегировать в пикомольных концентрациях в тех условиях, в которых другая днк ещё долго будет оставаться в растворе. Другое дело, кто эту днк сделает и как, но это другой вопрос.

ЗЫ Можно мне пдф статьи по ссылке? Я в декрете сейчас, из дома доступа нет. Хочу посмотреть, что они имеют в виду под ДНК.

Мой вопрос и правда слегка сферический, потому что мы не экспериментаторы и даже не биохимики. smile.gif Статья вот (dropbox). Они проводили эксперименты с длинами образцов в где-то сотню нуклеотидов, как с одноцепочечной, так и с двух, если я правильно понимаю. Мы отвечаем на вопрос об одноцепочечной ДНК. Ну, пусть для простоты это будет длиной эдак в тысячу... Если ты найдешь какую-то литературу, где оставили только противоионы, связанные с фосфатными группами, а всё свободно плавающее в растворе вынесли до каких-нибудь микромоль или наномоль, и при этом ДНК не свернулась в какашку, я буду бизумнащаслив.
BigUglyTurtle
24 июля 2016, 23:17
В ссылке чуваки как раз выбивают противоионы. Соль днк становится кислотой днк. Кислота имеет меньшую растворимость. Аггрегацию можно объяснить гидрофобными взаимодействиями оснований, вклад которых в случае свободной кислоты становится существенным. Грубо я так себе представляю картину, если противоионов достаточно, отрицательный заряд фосфатной цепи нейтрализован и днк сложены так, что основания внутри, фосфаты снаружи. Каждая молекула днк плавает отдельно. Когда противоионов становится недостаточно, то фосфаты одной цепи начинают сражаться за оставшиеся, электростатические взаимодействия сильнее гидрофобных, днк выворачивается так, что основания выпячиваются в раствор, притягивая основания такой же соседней днк. Вотте и агрегат.

Внимание, ответ. Если противоионы оставить, днк (обычная, как в статье, без приколов типа 100 dG подряд) будет растворима в деионизированной воде в миллимольных концентрациях как минимум, никакой аггрегации. Что отвечать рецензенту? А как он спросил?
Чокки
24 июля 2016, 23:23

BigUglyTurtle написала:
Внимание, ответ. Если противоионы оставить, днк (обычная, как в статье, без приколов типа 100 dG подряд) будет растворима в деионизированной воде в миллимольных концентрациях как минимум, никакой аггрегации. Что отвечать рецензенту? А как он спросил?

Да неважно что спросил рецензент. Наша задача — просто ткнуть рецензента носом в статьи, где убрали мобильные ионы и ДНК по-прежнему растворялась в воде, а не выпадала в осадок. Наличие ДНК в форме соли — не проблема. В идеале хотелось бы вообще (помимо протонов) чуть ли не микромоль на литр...
BigUglyTurtle
24 июля 2016, 23:52
Это обычная процедура, dna desalting, после неё остаются только днк в виде соли и вода (тут мы доверяем производителю воды, сколько он оставил ионов и каких). Schlaak et al Biotechnology Letters (2005) 27:1003-1005 сравнивает в том числе и методы обессоливания, никакой аггрегации не наблюдает ни в одном. Смысл там в том, что чем меньше остаточных солей, тем проводимость раствора ниже. Там, где им удалось добиться хороших результатов, считай никаких солей кроме днк нет.

В твоей ссылке они тоже растворяют в чистой воде и нет никакой аггрегации. Она начинается только когда днк уже не соль.

Такое ощущение, что рецензент тоже сильный теоретик, поэтому вопрос его странный. Ну, для биохимиков. Потому что встречались мне теоретики, просившие снять ямр воды при -273С для подтверждения их теорий безумных.
Чокки
25 июля 2016, 00:15

BigUglyTurtle написала:
Такое ощущение, что рецензент тоже сильный теоретик, поэтому вопрос его странный. Ну, для биохимиков. Потому что встречались мне теоретики, просившие снять ямр воды при -273С для подтверждения их теорий безумных.

Спасибо за ссылку. Рецензент — теоретик, и с 99% вероятности я знаю кто это. Суть ты поняла сразу: у нас есть устройство, в котором нужно минимизировать утечку тока за счет ионов. Гораздо более неприятный момент наличия ионов — это электрохимическая адсорбция долбаных ионов туда, где им быть крайне нежелательно. smile.gif
Dorothy
25 июля 2016, 00:35

mihalich написал: Растворима она сама по себе за счет PO3-, который как бы ее backbone. Солят для прецепитации и разного другого.

Ой, девочки, а я всегда солю, от соли фосфаты перестают друг друга пихать, и между bases гидрофобные взаимодействия сразу дуплекс стабилизируют, у меня так бабушка делала и меня научила. С магнием пробовала, получилось лучше, чем с калием, я его теперь даже в сахар кладу, он там такие комплексы образует – нарочно не разодрать, муж просил добавки.

BigUglyTurtle написала: Дуплекс это еще сама к себе или уже приклеилась? А если это шпилька?

Эти человеческие вопросы не для статьи по физике, где сферическая ДНК (хаха, смешно получилось) молча позирует для cъёмки 3D в колодезной воде при абсолютном нуле. Картинки нужны, типа - при комнатной температуре разваливается, если ниже чем, что там не вижу без очков, 1 mM «металла» (магния/ ртути/полония):
Чокки
25 июля 2016, 00:41

Dorothy написала:
Эти человеческие вопросы не для статьи по физике, где сферическая ДНК (хаха, смешно получилось) молча позирует для cъёмки 3D в колодезной воде при абсолютном нуле. Картинки нужны, типа - при комнатной температуре разваливается, если ниже чем, что там не вижу без очков, 1 mM «металла» (магния/ ртути/полония):

Што это было? У нас ДНК при 300К. Типа картинку вставила.
Dorothy
25 июля 2016, 00:48

Чокки написал: У нас ДНК при 300К.

Из K в C даже нефизику несложно будет перевести.
Чокки
25 июля 2016, 00:50

Dorothy написала:
Из K в C даже нефизику несложно будет перевести.

Я бы тебе, филфак, показал препринт, но ты ж потом мое фио сольешь в борг.
Dorothy
25 июля 2016, 01:02

Чокки написал: филфакфиоборг ёклмн

Pay no extra DNA charge.
Чокки
25 июля 2016, 01:15

Dorothy написала:
Pay no extra DNA charge.

Зачем ты мне продолжаешь втюхивать теоретическое? Мне надо экспериментальное.
Dorothy
25 июля 2016, 01:53

Чокки написал: экспериментальное

We also calculate the Tm's for the experimental sequences GCATGC (36), CCAAACA (78), CAAAGATTCCTC (83). Again our calculated results agree with the experimental data.


И экспериментальней некуда, от человека, избавляющегося от "металлов" для ESI-MS:

The presence of salt in the sample (such as 10 mM ammonium acetate) which provides counterions to shield phosphate anions (and hence minimize repulsion between strands*) was shown to be vital for ions corresponding to duplex ions to be observed.

Хотя 10 mM могли потребоваться компенсировать её 70'C source temperature. smile.gif

*BigUglyTurtle написала: Когда противоионов становится недостаточно, то фосфаты одной цепи начинают сражаться за оставшиеся, электростатические взаимодействия сильнее гидрофобных, днк выворачивается так, что основания выпячиваются в раствор, притягивая основания такой же соседней днк. Вотте и агрегат.

Чокки
25 июля 2016, 02:05
Дороти. Это статья по конформационной динамике двойной ДНК. Мне нужна всего лишь растворимость одиночной цепочки в воде. Есть разница.
Dorothy
25 июля 2016, 04:06

Чокки написал: одиночной цепочки

Тоже не развалится. smile.gif Современные технологии обессоливания из какого-нибудь жуткого рассола квашеной капусты не оставляют камня на камне. В результате видны десятые доли процента собственно "adducts" ssDNA-Na/K, и ничего вокруг. Без аггрегатов.
BigUglyTurtle
25 июля 2016, 18:08

Чокки написал: есть устройство, в котором нужно минимизировать утечку тока за счет ионов

А этого в тз не было. smile4.gif
Одно дело, деионизированная вода и через нее ток, другое дело раствор днк в деионизированной воде и через нее ток.
Чокки
25 июля 2016, 20:53

BigUglyTurtle написала:
Одно дело, деионизированная вода и через нее ток, другое дело раствор днк в деионизированной воде и через нее ток.

Представь себе что-то вроде много раз описанной фиговины: в водном окружении одноцепочечную ДНК протягивают через маленькую дырочку в твердотельной пластинке. Обычно в раствор специально добавляют электролит и смотрят на изменения ионного тока в процессе протяжки. Так вот, в нашем случае все мобильные ионы надо убрать. В твоих ответах на мои вопросы что-то принципиально изменится?
BigUglyTurtle
25 июля 2016, 22:29

Чокки написал: В твоих ответах на мои вопросы что-то принципиально изменится?

Я зупдавала на то, что днк-соль растворится в деионизированной воде и не выпадет в осадок. В том, что она не выпадет, если приложить ток, я сомневаюсь. Точнее, не сомневаюсь, что выпадет.

Этот чудный процесс протягивания через дырочку квакает как электрофорез? Так в него добавляют не просто электролит, а буфер. Как раз с целью иметь одинаковые условия по всему объему.
Чокки
25 июля 2016, 22:56

BigUglyTurtle написала:
В том, что она не выпадет, если приложить ток, я сомневаюсь.

Ток прикладывают только в экранизациях жизни Николы Теслы. smile.gif Физически — прикладывают разность потенциалов.
В данном случае, напряжение достаточно маленькое и локализованное в определенной части раствора, содержащего всю нашу хрень. И, как я уже говорил, цель лишь в идеале избавиться от всех ионов. В реальности, её желательно опустить до парочки миллимоль на литр и тогда все будут сравнительно щасливы.

Этот чудный процесс протягивания через дырочку квакает как электрофорез? Так в него добавляют не просто электролит, а буфер. Как раз с целью иметь одинаковые условия по всему объему.

Ну, протяжка в самом простом варианте как раз за счет электрофореза и происходит, хотя экспериментально осуществлены и другие варианты. В приборах MinION, если не ошибаюсь, протягивают с помощью ДНК-полимеразы, встроенной в твердую мембрану.

Если хочешь, мне будет гораздо проще поделиться с тобой текстом нашей статьи и я тебя с радостью вставлю в acknowledgment, а то мы тут всё ходим вокруг да около...smile.gif
m@gi
28 июля 2016, 23:13

Чокки написал:


Ну, протяжка в самом простом варианте как раз за счет электрофореза и происходит, хотя экспериментально осуществлены и другие варианты. В приборах MinION, если не ошибаюсь, протягивают с помощью ДНК-полимеразы, встроенной в твердую мембрану.


Чокки, так решение проблемы избавления ДНК от ионов магния нужно для проведения ПЦР?
А каковы вообще сами обьемы реакционной смеси?
Чокки
29 июля 2016, 00:43

m@gi написала:
Чокки, так решение проблемы избавления ДНК от ионов магния нужно для проведения ПЦР?
А каковы вообще сами обьемы реакционной смеси?

Нам не нужно ПЦР, нам нужно довести концентрацию любых мобильных ионов до абсолютного минимума, но такого, что ДНК остается растворенной в воде, а не выпадает в осадок. Объемов я не знаю, но в идеале это т.н. microfluidic system, то есть значительно меньше 1 кубического сантиметра. Не знаю, отвечаю ли на твой вопрос...
m@gi
1 августа 2016, 21:02

Чокки написал:
Нам не нужно ПЦР, нам нужно довести концентрацию любых мобильных ионов до абсолютного минимума, но такого, что ДНК остается растворенной в воде, а не выпадает в осадок. Объемов я не знаю, но в идеале это т.н. microfluidic system, то есть значительно меньше 1 кубического сантиметра. Не знаю, отвечаю ли на твой вопрос...

Прости, что долго не отвечала.. речь идет скорее всего о проточном методе секвинирования ДНК или что то похожее..
А экспериментальным путем нельзя разве выяснить предельно низкую концентрацию ионов магния в растворе, при которой ДНК не агрегируется. Если можно описать это цифрами - значениями кондуктивности, то было б совсем хорошо.
Чокки
1 августа 2016, 23:12

m@gi написала:
Прости, что долго не отвечала.. речь идет скорее всего  о проточном методе секвинирования ДНК или что то похожее..
А экспериментальным путем нельзя разве выяснить предельно низкую концентрацию ионов магния в растворе, при которой ДНК не агрегируется. Если можно описать это цифрами - значениями кондуктивности, то было б совсем хорошо.

Экспериментально можно, но мы не экспериментаторы. В принципе, со всем разобрались уже более-менее, спасибо. smile.gif
m@gi
1 августа 2016, 23:59

Чокки написал:
В принципе, со всем разобрались уже более-менее, спасибо. smile.gif

Удачи, тогда, интересные ж задачи решаетеsmile.gif
Чокки
6 сентября 2016, 01:47
Всем в этом чатике большое спасибо и чмоке, особенно BigUglyTurtle: статью примут в тот журнал, куда изначально послали (minor revision).
Чокки
16 сентября 2016, 23:45
Обубликовали, сучечки!
BigUglyTurtle, если хочешь, дай знать в приват и я поделюсь копией.
BigSister
17 сентября 2016, 00:11

Чокки написал: Обубликовали

Поздравляю smile.gif
Эта версия форума - с пониженной функциональностью. Для просмотра полной версии со всеми функциями, форматированием, картинками и т. п. нажмите сюда.
Invision Power Board © 2001-2017 Invision Power Services, Inc.
модификация - Яро & Серёга
Хостинг от «Зенон»Сервера компании «ETegro»